Lixuan Wei, Huanyao Gao, Jia Yu, Huan Zhang, Thanh Thanh L. Nguyen, Yayun Gu, Marie R. Passow, Jodi M. Carter, Bo Qin, Judy C. Boughey, Matthew P. Goetz, Richard M. Weinshilboum, James N. Ingle, Liewei Wang;Pharmakologisches Targeting des Androgenrezeptors löst kontextspezifische Wirkungen bei Östrogenrezeptor-positivem Brustkrebs aus.Cancer Res 1. Februar 2023;83 (3): 456–470.https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-1016Der Androgenrezeptor (AR) wird in 80 % bis 90 % der Östrogenrezeptor-α-positiven (ER+) Brustkrebserkrankungen exprimiert.Gesammelte Beweise haben gezeigt, dass AR ein Tumorsuppressor ist und dass seine Expression mit einer verbesserten Prognose bei ER+-Brustkrebs verbunden ist.Allerdings haben sowohl ein selektiver AR-Agonist (RAD140) als auch ein AR-Inhibitor (Enzalutamid, ENZ) eine therapeutische Wirkung bei ER+-Brustkrebs gezeigt, sodass das Potenzial für die klinische Anwendung einer AR-Targeting-Therapie bei ER+-Brustkrebs noch umstritten ist.In dieser Studie bewerteten wir die Wirksamkeit von ENZ und RAD140 in vivo und in vitro in AR+/ER+-Brustkrebsmodellen, charakterisierten die Beziehung von AR- und ER-Spiegeln zur Reaktion auf AR-Targeting-Medikamente und untersuchten die Veränderungen der globalen Genexpression und des Chromatins Bindung von AR und ERa nach ENZ-Behandlung.In der AR-Low-Einstellung fungierte ENZ direkt als ERα-Antagonist.Die Hemmung des Zellwachstums durch ENZ bei Brustkrebs mit niedriger AR-Expression war unabhängig von AR und stattdessen abhängig von ER.In AR-hohen Brustkrebsmodellen unterdrückte AR die ERα-Signalgebung und ENZ förderte die ERα-Signalgebung durch Antagonisierung von AR.Im Gegensatz dazu aktivierte RAD140 die AR-Signalgebung und unterdrückte das AR-hohe Tumorwachstum durch Deregulierung der ERα-Expression und Blockierung der ERα-Funktion.Insgesamt zeigt die Analyse der dynamischen Wirksamkeiten und Ergebnisse von AR-Agonisten und -Antagonisten in Gegenwart unterschiedlicher AR- und ERα-Spiegel Regulatoren des Ansprechens und unterstützt die klinische Untersuchung von ENZ in ausgewählten ER+-Tumoren mit einem niedrigen AR/ER-Verhältnis und AR-Agonisten in Tumoren mit einem hohen AR/ER-Verhältnis.Das Verhältnis von Androgenrezeptor zu Östrogenrezeptor bei Brustkrebs bestimmt das Ansprechen auf AR-gerichtete Therapien und bietet Richtlinien für die Entwicklung von AR-gerichteten Behandlungsstrategien für Patienten mit Brustkrebs.Brustkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte bösartige Erkrankung bei Frauen mit geschätzten 2,3 Millionen Neuerkrankungen im Jahr 2020 weltweit (1).Trotz Fortschritten bei der Erkennung und Behandlung bleibt diese Krankheit eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle (2, 3).Über 70 % der Brustkrebserkrankungen exprimieren Östrogenrezeptor α (ERα), einen Östrogen-aktivierten Transkriptionsfaktor, der Tumorwachstum und -progression antreibt (4, 5).Östrogensuppression und ER-Blockade sind die wichtigsten Ansätze zur Behandlung von ER+-Brustkrebs.Zugelassene adjuvante endokrine Therapien für ER+-Brustkrebs umfassen selektive ER-Modulatoren und Aromatasehemmer (AI; ​​Lit. 6).Bei Brustkrebs im Frühstadium haben endokrine Therapien das Wiederauftreten und die Sterblichkeit des Krebses erheblich verringert (7, 8).Allerdings treten bei etwa 20 % der ER+-Patienten nach 5 Jahren adjuvanter endokriner Therapie erneut Metastasen auf (8).Daher werden dauerhaftere und wirksamere Therapeutika benötigt, um Rezidive bei Brustkrebs im Frühstadium zu verringern.Der Androgenrezeptor (AR) wird in 80 % bis 90 % von ER+-Brustkrebs exprimiert (4, 5, 9) und eine höhere Expression von AR ist mit einem verbesserten Gesamtüberleben (OS) und krankheitsfreiem Überleben (DFS) verbunden; Lit. 5 , 9–11).Die Rolle von AR im Zusammenhang mit ER+ Brustkrebs ist seit langem umstritten.Einige Forscher behaupteten, AR sei ein onkogenes Protein.Sie fanden heraus, dass der native Ligand von AR (5α-Dihydrotestosteron, DHT) das Wachstum von ER+-Brustkrebs stimulierte (12, 13).Es wurde auch berichtet, dass DHT die Metastasierung von ER+-Brustkrebs fördert, indem es die E-Cadherin- und Vimentin-Expression epigenetisch hochreguliert (14).Eine kürzlich durchgeführte klinische Studie mit Enzalutamid, dem AR-Blocker bei ER+, zeigte auch die potenziellen Vorteile von ENZ in einer Subpopulation (15).AR-Abbaumittel war wirksam bei der Unterdrückung des Wachstums von ER+-Brustkrebszelllinien (16).Es gibt jedoch immer mehr Beweise dafür, dass AR ein Tumorsuppressor bei ER+-Brustkrebs ist.Androgene zeigten eine tumorunterdrückende Wirkung (17) und wurden im 20. Jahrhundert zur Behandlung von Brustkrebs eingesetzt (18, 19).Die Behandlung mit Androgen hemmt die Zellproliferation auf unterschiedliche Weise.Es kann die ER-abhängige Transkription stören, indem es um die Bindung an dieselben Stellen konkurriert oder die ER-Bindung an die DNA erleichtert (20).Gemeinsame Koaktivatoren könnten auch an der transkriptionellen Interferenz von ERa beteiligt sein, die durch AR-Überexpression verursacht wird (21).Darüber hinaus induzierte die AR-Aktivierung eine ER-beta-Hochregulierung und eine miR-21-Herunterregulierung, die zur Schutzwirkung von AR beitragen (22).Insbesondere hat eine kürzlich durchgeführte Studie die Tumorsuppressor-Rolle von AR aufgezeigt (23).Die genomische Verteilung von ER und essentiellen Coaktivatoren (p300, SRC-3) wurde durch die AR-Aktivierung verändert, was zur Repression von ER-regulierten Zellzyklusgenen und einer Hochregulierung von AR-Zielgenen führte.Interessanterweise weisen einige Studien darauf hin, dass AR für die Metastasierung und die endokrine Resistenz bei ER+-Brustkrebs verantwortlich ist.AR-Expressionsniveaus sind in Knochenbiopsien von metastasiertem Brustkrebs erhöht und korrelieren mit der Dauer der Behandlung mit AIs (24).AR-Überexpression induziert Tamoxifen- und Anastrozol-Resistenz in Brustkrebszellen (25, 26).Diese Ergebnisse liefern eine Begründung für das Targeting von AR bei Patientinnen mit Brustkrebs im Frühstadium und mit endokrinresistentem Brustkrebs.Obwohl sowohl AR-Agonisten als auch -Antagonisten eine therapeutische Wirkung auf ER+-Brustkrebs gezeigt haben, ist unklar, welches Tumorprofil von der Stimulierung von AR im Vergleich zur Hemmung von AR profitieren könnte.Enzalutamid (ENZ), ein AR-Antagonist, beeinträchtigt die AR-Signalgebung, hemmt die Proliferation von ER+/AR+-Brustkrebszellen und stellt die Empfindlichkeit von Antiöstrogentherapien wieder her (27, 28).Die In-vivo- oder klinische Wirksamkeit von ENZ ist nicht nachgewiesen.ENZ hemmte das Östrogen-stimulierte Wachstum von MCF7- und PT12-Xenotransplantat-Tumoren und zeigte unterdrückende Wirkungen auf das Wachstum von Tamoxifen-resistenten MCF7-Xenotransplantaten (27, 28).ENZ beeinflusste jedoch nicht das Wachstum von ZR75–1-Xenotransplantaten (23) oder endokrinresistenten, von Patienten stammenden Xenotransplantaten (PDX; Lit. 29).Die Kombination von ENZ und Exemestan zeigte kein verbessertes progressionsfreies Überleben (PFS) im Vergleich zu Exemestan allein, obwohl es einen potenziellen Nutzen in einer Subpopulation zeigte (15).Wie bereits erwähnt, ist die Wirkung von AR-Agonisten auf die Proliferation von ER+-Brustkrebs umstritten.Kürzlich zeigten die selektiven AR-Modulatoren (SARM) RAD140 und Enobosarm potenzielle klinische Vorteile bei ER+-Brustkrebs (23, 30).RAD140 unterdrückte das Wachstum von ER+/AR+-Brustkrebs, indem es die AR-Signalgebung stimulierte, was zu einer Herunterregulierung von ERα führte (30).DHT hemmte die östrogenregulierte Genexpression, den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) und die Fernmetastasierung in ESR1-mutierten Tumoren (31).Diese abweichenden Ergebnisse haben die Implementierung von AR-Targeting-Therapien erheblich verwirrt.Die therapeutische Wirksamkeit von AR-Agonisten und AR-Antagonisten muss geklärt werden, um ihre klinische Anwendung besser charakterisieren zu können.Daher untersuchten wir die ENZ- und RAD140-Antwort in mehreren ER+-Brustkrebszellen und PDX-Modellen und zeigten die Genexpression und genomische Bindungsveränderungen nach medikamentöser Behandlung.Unsere Ergebnisse unterstützen die klinischen Studien mit ENZ, einem AR-Antagonisten, bei ausgewählten ER+-Tumoren mit einem niedrigen AR/ER-Verhältnis und mit RAD140, einem AR-Agonisten, bei Tumoren mit einem hohen AR/ER-Verhältnis.Humane Brustkrebszelllinien wurden von der ATCC (Brustkrebszellpanel, 30–4500KTM) erworben.Alle Zelllinien wurden durch STR-Analyse charakterisiert und auf Mycoplasma-Infektionsfreiheit getestet (IDEXX Laboratories).T47D (CVCL_0553)- und HCC1419 (CVCL_1251)-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS gehalten.MCF7 (CVCL_0031), CAMA1 (CVCL_1115) und HEK293T (CVCL_0063)-Zellen wurden in EMEM-Medium mit 10 % FBS gehalten.MCF10A (CVCL_0598) wurde von der ATCC bezogen und gemäß ihrer Anweisung gewartet.Alle Zellen wurden in einer Atmosphäre mit 5 % CO 2 und 37 °C gezüchtet.Die in allen Experimenten verwendeten Zellen hatten weniger als 10 Passagen.Die in dieser Studie verwendeten Verbindungen wurden von Selleckchem (ENZ, S1205; RAD140, S5275; Apalutamide, S2840; Darolutamide, S7559), Cayman Chemical (RD162, 13039) und Sigma (E2, E2758, DHT, D073) erworben.Doxycyclin wurde von Takara (631311) bestellt.Menschliches AR in voller Länge wurde in den PCMV6-XL4-Vektor (Origene), den pLVX-Puro-Vektor (Takara Bio) und den Lenti-X Tet-One Inducible-Vektor (Takara Bio) kloniert.Menschliches ESR1 wurde in den PCMV6-XL4-Vektor und den induzierbaren Lenti-X Tet-One-Vektor kloniert.ESR1-shRNAs wurden in den pLKO.1-Vektor (Sigma) kloniert.Menschliches AR wurde mittels Edit-R CRISPR-Cas9-Gentechnik mit Cas9-Nuklease-Expressionsplasmiden (Kat.-Nr. U-005100–120), synthetischer CRISPR-RNA (crRNA) und transaktivierendem CRISPR-RNA-System (tracrRNA) (Dharmacon) ausgeknockt.Die Zielsequenzen von shRNA, siRNA und crRNA sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt.Lentivirus-Plasmide wurden unter Verwendung eines VSV-G lentiviralen Verpackungskits (631275, Takara) verpackt.Verpacktes Lentivirus wurde in HEK293T-Zellen produziert.MCF7- und T47D-Zellen wurden mit dem angegebenen Lentivirus in Gegenwart von 10 &mgr;g/ml Polybrene infiziert.Transduzierte MCF7- und T47D-Zellen wurden 2 Tage kultiviert.Positive Zellen wurden unter Verwendung von Puromycin bei 1 &mgr;g/ml für 2 Wochen selektiert.Einzelne Zellen wurden entnommen und für 1 bis 2 Monate in Vollmedium kultiviert.Isolierte Klone wurden mittels Immunoblot und qRT-PCR analysiert.Für den AR-Gen-Knockout wurden MCF7- und T47D-Zellen mit Cas9-Nuklease-Expressionsplasmid transfiziert und 1 Woche lang mit Puromycin selektiert.Die Mischung aus drei auf crRNA gerichtetem AR und tracrRNA wurde in Cas9-positive Zellen cotransfiziert.Die Zellen wurden mit 100 Zellen pro Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät.Einzelne Klone wurden mittels Western Blot getestet.Für Proliferationsassays wurden Zellen in Medium mit 10 % CSS mit 2.000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und einer Behandlung mit ENZ, RAD140, DHT oder DMSO für 5 oder 12 Tage unterzogen, wobei die Behandlungen alle 3 Tage erneuert wurden.Die Zelllebensfähigkeit wurde unter Verwendung des CyQUANT-Kits (C7026, Thermo Fisher Scientific) gemessen.Jedes Experiment mit drei Wiederholungen wurde dreimal durchgeführt.Für den Koloniebildungsassay wurden 500 Zellen zweifach in 6-Well-Platten ausgesät und wachsen gelassen, bis sich sichtbare Kolonien in vollständigem Wachstumsmedium oder Steroid-gestripptem Medium bildeten (3–6 Wochen).Für Behandlungen wurden ENZ, RAD140, DHT oder DMSO am folgenden Tag nach dem Aussäen der Zellen hinzugefügt und alle 3 Tage erneuert.Gesamt-RNA wurde aus Zelllinien oder gefrorenen Tumorgeweben unter Verwendung des RNA-Isolierungskits (74134, Qiagen) extrahiert.Eine einstufige qRT-PCR wurde dreifach unter Verwendung der SYBR Green-Methode (4389986, Thermo Fisher Scientific) auf dem QuantStudio-Echtzeit-PCR-System (Thermo Fisher Scientific) mit den Primern (Ergänzungstabelle S1) durchgeführt.Die Messung der individuellen RNA-Expression wurde relativ zu den Niveaus des GAPDH-Transkripts bestimmt.Proteinextrakte aus Zellen wurden unter Verwendung von RIPA-Lysepuffer hergestellt.Nukleare und zytoplasmatische Proteine ​​wurden unter Verwendung von NE-PER Nuklear- und zytoplasmatischen Extraktionsreagenzien (78833, Thermo Fisher Scientific) isoliert.Die Zelllysatkonzentration wurde mit Protein Assay Dye (Bio-Rad) gemessen.Proteine ​​wurden in SDS-PAGE aufgelöst, gefolgt von einer Immunoblot-Analyse.Die verwendeten Antikörper sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt.Die Intensität der Bande wurde mit der ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/ij/) quantifiziert.Die Transkriptionsaktivität von ERa wurde unter Verwendung des dualen Luciferase-Assays mit dem Cignal ERE Reporter Assay Kit (Qiagen) gemessen.AR-CRISPR-Knockout- und Kontroll-T47D-Zellen wurden 48 Stunden lang in mit Aktivkohle gestripptem Serummedium kultiviert und dann 1 Tag lang auf serumfreies Medium in Platten mit 48 Vertiefungen umgestellt.Die Zellen wurden dann mit ERE-Reporterkonstrukten unter Verwendung des Transfektionsreagens Lipofectamine 2000 transfiziert.Nach 24 Stunden Transfektion wurden die Zellen 24 Stunden lang mit E2, ENZ oder E2 plus ENZ behandelt.Luciferase wurde unter Verwendung des Dual-Luciferase Reporter Assay System von Promega gemäß dem Protokoll des Herstellers getestet.Rekombinantes humanes AR- und ERα-Protein in voller Länge, bestellt bei Creative Biomart.[3H]-ENZ und [3H]-17β-Estradiol wurden von PerkinElmer synthetisiert.Assay-Puffer (10 mmol/L Tris-HCl; 1 mmol/L EDTA; 1 mmol/L EGTA; 1 mmol/L NaVO3; 1 % Glycerol; 0,25 mmol/L Leupeptin; 1 % BSA; 1 mmol/L DTT). eine Woche vor den Experimenten zubereitet.ERα-Sättigungsbindungsassays wurden durchgeführt, um die Gesamtbindung und die unspezifische Bindung (NSB) zu messen.1 nmol/L ERα wurde mit radioaktivem ENZ (1–500 nmol/L) über Nacht bei 4°C inkubiert.Zur Bestimmung von NSB wurde ein 100-facher Überschuss an kaltem ENZ zugegeben und zusammen inkubiert.AR-Sättigungsbindungsassay mit 0,5 bis 25 nmol/l heißem ENZ, 1.000 × kalter Verbindung und 100 nmol/l AR-Protein in der Reaktion.Gebundene und ungebundene Liganden wurden durch 10-minütige Inkubation mit eiskalter Dextran-beschichteter Aktivkohle auf Eis getrennt.Die Radioaktivität von gebundenen Liganden wurde dann unter Verwendung eines Beckmann LS 6500 Flüssigszintillationszählers (Ramsey) gemessen.Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante für den Radioliganden (KD) wurde unter Verwendung einer nichtlinearen Regressionsanalyse berechnet.[3H]-17β-Östradiol-Verdrängungsassays wurden unter denselben Bedingungen unter Verwendung von 1 nmol/l heißem Östradiol und steigenden Konzentrationen von nichtradioaktivem Liganden durchgeführt, z. B. kaltem Östradiol (10 nmol/l–100 μmol/l) oder ENZ (1– 200 μmol/l).Konkurrenzkurven wurden als Prozentsatz der Bindung von heißem Östradiol gegen zunehmende Konzentrationen von unmarkierten Liganden aufgetragen.MCF7-Tet-Zellen wurden verwendet, um AR-low- (kein Doxycyclin) und AR-high-Zellen (Doxycyclin 800 ng/ml) zu erzeugen.Doxycyclin wurde 1 Tag vor den medikamentösen Behandlungen zu Zellkulturmedien gegeben.Eltern- und AROE-MCF7-Zellen wurden 24 Stunden lang mit DMSO oder Enzalutamid (10 μmol/l) behandelt.Eine Kontrollprobe und doppelte Proben unter ENZ-Behandlung wurden für die RNA-Sequenzierung gesammelt.Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNeasy Plus Mini-Kits (74134, Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.Die Vorbereitung und Sequenzierung der mit Poly-A angereicherten RNA-Bibliothek erfolgte mit Mayo Next Gen-Sequenzierungskernen unter Verwendung des Illumina truseq2-Kits.Einzelne Bibliotheken wurden gepoolt und auf einem HiSeq 4000-System (2 × 150 Paired-End, Illumina) ausgeführt.Gefilterte Reads wurden unter Verwendung von STAR mit einer durchschnittlichen Mapping-Rate von 93 % mit dem menschlichen hg38-Referenzgenom abgeglichen.Rohzählungen wurden dann von HTSeq aufgerufen, wobei nicht eindeutig zugeordnete Lesevorgänge ausgeschlossen wurden.Die differentielle Expressionsanalyse wurde mit dem EdgeR-Paket unter Verwendung der R-Software durchgeführt.Die Upstream-Analyse wurde in der Software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) durchgeführt (32).Genset-Anreicherung und Pfadanalysen wurden unter Verwendung des öffentlichen Servers des Broad Institute (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp) mit Standardparametern implementiert.Die AR-Expression wurde durch Doxycyclin (800 ng/ml) für 24 Stunden in MCF7-Tet-Zellen induziert.Die Zellen wurden 2 Stunden lang mit DMSO oder ENZ (10 &mgr;mol/l) behandelt.1 × 10 8 Zellen wurden in 1 % Formaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und 0,1 Volumen von 2 Mol/L Glycin wurden hinzugefügt, um die Reaktion zu quenchen.Die Zelllyse wurde beschallt, um das Chromatin auf 200–300 bp zu fragmentieren.Solubilisiertes Chromatin wurde einer Immunpräzipitation mit den AR- und ERα-Antikörpern unterzogen (Ergänzungstabelle S2).Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung wurden im Epigenomics Development Laboratory der Mayo Clinic durchgeführt.Bibliotheken wurden mit 100-bp-Paired-End-Reads auf der Illumina-Plattform in der Mayo Clinic sequenziert.Sequenzabgleich und Peak-Calling wurden vom Bioinformatik-Kern der Mayo-Klinik durchgeführt.Die Sequenzen wurden unter Verwendung der BWA-Version 0.7.17 mit dem Human Reference Genome (Assembly hg38, UCSC, Dezember 2013) abgeglichen.Angereicherte Regionen des Genoms wurden durch Vergleich der Chromatin-Immunpräzipitationsproben (ChIP) mit Eingabeproben unter Verwendung der MACS2-Peak-Caller-Version 2.1 (Padj < 0,01) identifiziert.Nach der Identifizierung eines gemeinsamen Satzes von Peaks wurden überlappende Peaks mit dem ChIPpeakAnno-Paket in R analysiert (max. Peak-Lücke, 1 kb).Die Motivanreicherung wurde mit der HOCOMOCO-Datenbank getestet und in der MEME-Suite (https://meme-suite.org/meme/doc/meme-chip.html) durchgeführt.Die Heatmaps der rohen ChIP-seq-Daten wurden mit deepTools 2.0 (https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/) generiert.Die Peaks um bestimmte Gene wurden im WashU Epigenome Browser (https://epigenomegateway.wustl.edu/) angezeigt.Tierexperimente mit MCF7-Zelllinien und PDX-Modellen wurden an der Mayo Clinic unter Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt (Protokoll-ID: A00005364–20).Sechs bis acht Wochen alte weibliche NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ-Mäuse wurden in allen Tiermodellen verwendet (IMSR_JAX:005557, The Jackson Laboratory).Diese Xenograft-Modelle wurden mit exogenem Östradiol in Trinkwasser (8 mg/ml, 2/Woche aufgefrischt) ergänzt.Zehn Millionen Zellen wurden in 100 μl Matrigel suspendiert und in das Brustfettpolster injiziert, um Zelllinien-Xenotransplantate zu erzeugen.Die ER+-Brustkrebs-PDX-Modelle wurden durch subkutane Implantation von Tumorfragmenten in die Flanke von weiblichen Mäusen etabliert.Die Zelllinie oder PDXs mit Volumina zwischen 100 und 200 mm3 wurden in Behandlungsgruppen aufgenommen.Enzalutamid oder RAD140 wurde als Monotherapie oder in Kombination mit Fulvestrant verabreicht.ENZ (25 mg kg – 1 d – 1) und RAD140 (50 mg kg – 1 d – 1) wurden in 0,5 % Carboxymethylcellulose resuspendiert und 5 Mal wöchentlich per Schlundsonde verabreicht.Fulvestrant wurde als subkutane Injektion verabreicht (2 mg/Woche in Sesamöl).Tumorvolumen und Körpergewicht wurden zweimal pro Woche gemessen.Das Tumorvolumen wurde anhand der Formel (Länge × Breite2) / 2 berechnet. Nach Erreichen der experimentellen Endpunkte wurden die Mäuse getötet und die Primärtumoren zur weiteren Analyse bei –80 °C gehalten.MCF7- und MCF7-AROE-Fremdtransplantattumoren wurden entfernt und in neutral gepuffertem 10%igem Formalin bei Raumtemperatur für 24 Stunden fixiert, bevor sie in Paraffin eingebettet und geschnitten wurden.Schnitte wurden im Animal Histology Core Laboratory der Mayo Clinic hergestellt.Gewebeschnitte von MCF7- und MCF7-AROE-Xenotransplantaten wurden entparaffiniert und dann einer AR-, ERa- und Ki67-Immunchemie gemäß den Anweisungen des Herstellers Diaminobenzidin (DAB 150, Millipore) unterzogen.Als chromogenes Substrat wurde stabiles DAB verwendet und die Schnitte mit einer Hämatoxylinlösung gegengefärbt.Fotos des gesamten Querschnitts wurden mit dem Diascanner Aperio AT2 (Leica) digitalisiert.Brustkrebsgewebe-Mikroarray (TMA) wurde von US Biomax (BR2089) gekauft.AR- und ER-IHC wurden im CAP/CLIA-zertifizierten klinischen IHC-Labor (Mayo Clinic) mit Ventana Medical Systems (Roche) durchgeführt.Die verwendeten Antikörper wurden in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt.In jedem Gewebekern wurde der Prozentsatz der AR- oder ER-immunreaktiven invasiven Tumorkerne pro insgesamt auswertbaren invasiven Tumorkernen manuell in Dezilschritten (0 %–100 %) bewertet.Die durchschnittliche Färbeintensität der immunreaktiven Kerne wurde halbquantitativ auf einer Skala von 0 bis 3 (keine, schwach, mittel und stark) bewertet.Der Prozentsatz entspricht dem Prozentsatz der Tumorkernfärbung.Die Expressionsniveaus wurden bewertet, indem der Prozentsatz positiver Zellen mit der Intensität multipliziert wurde.Statistische Berechnungen wurden unter Verwendung von GraphPad Prism (GraphPad Software) und R 4.1.2 Software durchgeführt.In-vitro-Proliferations- und Koloniebildungsexperimente wurden durch den zweiseitigen Student-t-Test analysiert.Die Daten der Tumorwachstumskurve wurden an einem ethischen Endpunkt unter Verwendung eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests analysiert.Die mRNA-Expression von Xenotransplantaten und das Gewicht der Mäuse in den verschiedenen Behandlungsgruppen wurden unter Verwendung eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests verglichen.Lineare Regression wurde verwendet, um den Zusammenhang zwischen der Dosis-Wirkungs-AUC und den AR-, ER- oder AR/ER-Spiegeln zu testen.Der zweiseitige Spearman-Korrelationstest wurde verwendet, um die Beziehung zwischen AR- und ERa-Expression zu analysieren.Der zweiseitige, ungepaarte Student-t-Test wurde verwendet, um den Unterschied zwischen AR-, ER- oder AR/ER-Spiegeln bei primärem und metastasierendem Brustkrebs zu testen.Überlebenskurven wurden nach der Kaplan-Meier-Methode aufgetragen und mit dem Log-Rank-Test verglichen.Wenn nicht anders angegeben, stellen alle Werte Mittelwerte von mindestens drei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung dar.P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen (*, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001).Die in dieser Studie berichteten RNA-seq- und ChIP-seq-Daten sind bei Gene Expression Omnibus (GEO, GSE200300 ChIP-seq, GSE200435 RNA-seq) erhältlich.Alle anderen Daten sind auf angemessene Anfrage beim korrespondierenden Autor (Liewei Wang, Wang.Liewei@mayo.edu) erhältlich.Um die Antitumorwirksamkeit einer AR-Targeting-Therapie und Mechanismen zu untersuchen, die widersprüchlichen Ergebnissen bei der Anwendung von AR-Agonisten gegenüber Antagonisten zugrunde liegen, haben wir zunächst die Zellwachstumshemmungsrate des AR-Agonisten (DHT) und des AR-Antagonisten (ENZ) unter Verwendung von ER+-Zelllinien getestet .Wir haben die AR- und ER-Spiegel in ER+-Zelllinien gemessen und festgestellt, dass HCC1419 und CAMA1 eine relativ höhere AR-Expression aufweisen als T47D und MCF7 (ergänzende Abb. S1A).In MCF7- und T47D-Zellen mit relativ geringer AR-Expression hemmte ENZ das Zellwachstum erheblich, aber DHT hatte innerhalb des normalen physiologischen Bereichs (33) keine Auswirkungen auf das Zellwachstum im Vergleich zur DMSO-Behandlung (Abb. 1A und B; ergänzende Abb. S1B und S1C).Alternativ beobachteten wir in HCC1419- und CAMA1-Zellen eine signifikante Verringerung des Zellwachstums nach der DHT-Behandlung, aber keine Veränderung bei der ENZ-Behandlung (Abb. 1C und D und ergänzende Abb. S1D und S1E).Darüber hinaus stellten wir fest, dass DHT die Zellwachstumsraten verringerte, wenn sein Ziel, AR, in MCF7- und T47D-Zellen überexprimiert wurde (ergänzende Abb. S1F–S1H).RAD140, ein Brustgewebe-selektiver AR-Agonist (30), zeigte auch wachstumshemmende Wirkungen in Zellen mit hoher AR.Im Gegensatz zu RAD140 beeinträchtigte ENZ die Zellproliferation nur in MCF7- und T47D-Zellen.Überraschenderweise förderte ENZ sogar das Zellwachstum in CAMA1-Zellen (Abb. 1E–H).Um das Arzneimittel-Reaktionsprofil in zwei Untergruppen von Zellen weiter zu bestätigen, erzeugten wir stabile AR-überexprimierte MCF7-Zellen, wählten 3 einzelne Klone mit unterschiedlichen AR-Expressionsniveaus aus (Abb. 1I) und bewerteten die Antiproliferationsaktivität von Arzneimitteln in Kontroll- und AR- überexprimierte Zellen.Wie von uns erwartet, hemmte der AR-Agonist RAD140 das Zellwachstum, wenn AR viel stärker exprimiert wurde als Kontrollzellen (AR-PLVX3#2 und AR-PLVX3#3 vs. PLVX3).Inzwischen wurden diese AR-Überexpressionszellen resistenter gegen ENZ (Abb. 1J).Wir haben auch AR in HCC1419, einer Zelle mit hoher AR, niedergeschlagen und die Reaktion von ENZ und RAD140 getestet.Wir fanden heraus, dass AR-Knockdown (KD)-Zellen empfindlicher auf ENZ reagierten als Elternzellen (ergänzende Abb. S1I und S1J).Die zellwachstumshemmende Wirkung von RAD140 wurde beeinträchtigt, wenn AR niedergeschlagen wurde (ergänzende Abb. S1K).Kürzlich wurde berichtet, dass AR ein Tumorsuppressor bei ER+-Brustkrebs ist und ein AR-Agonist zur Behandlung von ER+-Brustkrebs eingesetzt werden kann (23).In unseren Experimenten fanden wir heraus, dass der AR-Agonist nur „hohe“ AR-Brustkrebszellen hemmte und ENZ eine bessere wachstumshemmende Wirkung auf „niedrige“ AR-Zellen hatte, was darauf hindeutet, dass die Wirksamkeit von AR-gerichteten Medikamenten weitgehend vom Kontext der AR abhängt und ERa-Status.Die Reaktion von AR-Agonisten und -Antagonisten in ER+-Brustkrebszelllinien.A–F, Relative Anzahl von Zellen, die in Gegenwart von DMSO, DHT, ENZ und RAD140 gezüchtet wurden.A, B und E, der AR-Antagonist ENZ hemmte das Zellwachstum und der AR-Agonist DHT oder RAD140 beeinflusste die Zellproliferation in MCF7- und T47D-Zellen nicht.C, D und F, AR-Agonist DHT oder RAD140 verringerten das Zellwachstum.Die Langzeitexposition (> 9 Tage) des AR-Antagonisten förderte das Zellwachstum in CAMA1- und HCC1419-Zellen.G und H, Koloniebildungsassays mit DMSO-, ENZ- oder RAD140-Behandlung in vier Zelllinien.G-, MCF7- und T47D-Zellen.H-, CAMA1- und HCC1419-Zellen.Zellkolonien wurden durch ENZ in MCF7- und T47D-Zellen deutlich reduziert.RAD140 beeinträchtigte die Bildung von Zellkolonien in CAMA1- und HCC1419-Zellen.I, Immunoblot-Analyse von stabilen MCF7-Zelllinien, die den Kontrollvektor (PLVX3) und AR (AR-PLVX3) exprimieren.Die relativen AR-Proteinspiegel wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert.J, Repräsentative Bilder und Quantifizierung von Koloniebildungsassays in MCF7-Kontroll- und AR-Überexpressionszellen mit DMSO-, ENZ- oder RAD140-Behandlung.ENZ-Effekte wurden in kompletten Medien getestet.Die RAD140-Behandlung wurde im hormonabgereicherten Medium durchgeführt.Für Proliferationsassays wurden die relativen Zellzahlen in DMSO- und Arzneimittelbehandlungen am letzten Tag der Beobachtung (4, 5 oder 12 Tage) verglichen.Bei der Quantifizierung der Zellkolonie wurden Vergleiche zwischen AR-PLVX3 und PLVX3 durchgeführt.Alle Fehlerbalken repräsentieren SD.Zweiseitiger Student-t-Test, *, P < 0,05;**, P < 0,01;***, P < 0,001.Die Reaktion von AR-Agonisten und -Antagonisten in ER+-Brustkrebszelllinien.A–F, Relative Anzahl von Zellen, die in Gegenwart von DMSO, DHT, ENZ und RAD140 gezüchtet wurden.A, B und E, der AR-Antagonist ENZ hemmte das Zellwachstum und der AR-Agonist DHT oder RAD140 beeinflusste die Zellproliferation in MCF7- und T47D-Zellen nicht.C, D und F, AR-Agonist DHT oder RAD140 verringerten das Zellwachstum.Die Langzeitexposition (> 9 Tage) des AR-Antagonisten förderte das Zellwachstum in CAMA1- und HCC1419-Zellen.G und H, Koloniebildungsassays mit DMSO-, ENZ- oder RAD140-Behandlung in vier Zelllinien.G-, MCF7- und T47D-Zellen.H-, CAMA1- und HCC1419-Zellen.Zellkolonien wurden durch ENZ in MCF7- und T47D-Zellen deutlich reduziert.RAD140 beeinträchtigte die Bildung von Zellkolonien in CAMA1- und HCC1419-Zellen.I, Immunoblot-Analyse von stabilen MCF7-Zelllinien, die den Kontrollvektor (PLVX3) und AR (AR-PLVX3) exprimieren.Die relativen AR-Proteinspiegel wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert.J, Repräsentative Bilder und Quantifizierung von Koloniebildungsassays in MCF7-Kontroll- und AR-Überexpressionszellen mit DMSO-, ENZ- oder RAD140-Behandlung.ENZ-Effekte wurden in kompletten Medien getestet.Die RAD140-Behandlung wurde im hormonabgereicherten Medium durchgeführt.Für Proliferationsassays wurden die relativen Zellzahlen in DMSO- und Arzneimittelbehandlungen am letzten Tag der Beobachtung (4, 5 oder 12 Tage) verglichen.Bei der Quantifizierung der Zellkolonie wurden Vergleiche zwischen AR-PLVX3 und PLVX3 durchgeführt.Alle Fehlerbalken repräsentieren SD.Zweiseitiger Student-t-Test, *, P < 0,05;**, P < 0,01;***, P < 0,001.Die Beobachtung, dass ENZ in AR-niedrigen Zellen eine bessere Hemmung aufwies, veranlasste uns zu der Hypothese, dass ENZ in diesen Zellen möglicherweise nicht auf sein kanonisches Ziel AR abzielt.Wir haben AR-Knockout (ARKO) MCF7- und T47D-Zellen mit dem CRISPR/cas9-System erzeugt und die ENZ-Reaktion in Kontroll- und ARKO-Zellen getestet.Die Ergebnisse zeigten, dass die zellwachstumshemmende Wirkung von ENZ nicht signifikant beeinträchtigt war, wenn der AR ausgeschaltet war, was darauf hindeutet, dass ENZ möglicherweise nicht-kanonische Ziele in Zellen hat, denen der AR fehlt (Abb. 2A–D).Um den Mechanismus von ENZ besser zu verstehen, der der Beobachtung in den beiden Gruppen von Brustkrebszellen zugrunde liegt, die auf der Grundlage von AR-Spiegeln ausgewählt wurden, haben wir MCF7-Zellen mit Tet-induzierter AR-Überexpression (ergänzende Abb. S2A) erstellt und eine RNA-Sequenzierung mit DMSO oder ENZ durchgeführt Behandlung sowohl in Kontrollzellen als auch in AR-Überexpressionszellen.Wir identifizierten 193 differentiell exprimierte Gene (76 nach oben und 117 nach unten) zwischen DMSO- und ENZ-behandelten elterlichen MCF7-Zellen (FC > 2 oder < 0,5, FDR < 0,05, Ergänzungstabelle S3).Um die Signalwege zu bestimmen, auf die ENZ in elterlichen MCF7-Zellen abzielt, wo wir eine Zellwachstumshemmung sahen, führten wir die Upstream-Analyse mit den 193 ENZ-betroffenen Genen in MCF7-Zellen unter Verwendung von IPA-Software durch (32).Die Ergebnisse zeigten, dass ER der vorgeschaltete Regulator dieser differentiell exprimierten Gene sein könnte, die durch ENZ reguliert werden, und es wurde vorhergesagt, dass die ER-Signalübertragung nach ENZ-Behandlung gehemmt wird (P = 1,69 × 10 –10 , Abb. 2E).Wir führten eine globale ERα-ChIP-seq in MCF7-Elternzellen durch, die mit DMSO oder ENZ inkubiert wurden, und stellten fest, dass 39,58 % (8.681/21.933) der ER-gebundenen Stellen durch ENZ (Abb. 2F, Lost ERBS) abgeschafft wurden und die Bindungsintensität signifikant verringert war nach ENZ-Behandlung in 12.868 konservierten ER-Bindungsstellen (Fig. 2F und G).Wir beobachteten eine signifikant verringerte Wirkung von ENZ auf die Koloniebildung in ER-Knockdown-Zellen (ERKD) im Vergleich zu Kontrollzellen (Abb. 2H und I; ergänzende Abb. S2B).Diese Beobachtung legt nahe, dass ENZ das Zellwachstum in AR-niedrigen ER+-Zellen hemmt, indem es die genomische ERα-Bindung verringert und die ERα-Signalgebung unter hormonübersättigten Bedingungen blockiert, was mit zuvor veröffentlichten Berichten übereinstimmt, dass ENZ die Östradiol (E2)-vermittelte Proliferation und genomische ERα-Bindung reduziert in MCF7-Zellen (27).ENZ antagonisierte die ERα-Aktivität in Zellen mit geringer AR-Häufigkeit.A, Zellwachstumskurven unter Behandlung mit DMSO und 10 und 20 μmol/l ENZ von elterlichen und AR-Knockout-MCF7-Zellen.Zwei Signalkolonien von Knockout-Zellen wurden ausgewählt.B, Western Blot, der die AR-Expression in elterlichen und AR-Knockout-MCF7-Zellen zeigt.C, Zellwachstumskurven unter Behandlung mit DMSO und 10 und 20 μmol/l ENZ von parentalen und AR-Knockout-T47D-Zellen.Zwei Signalkolonien von Knockout-Zellen wurden ausgewählt.D, Western Blot, der die AR-Expression in parentalen und AR-Knockout-T47D-Zellen zeigt.E, Upstream-Regulatoren von ENZ-betroffenen Genen.Die 193 differentiell exprimierten Gene nach ENZ-Behandlung (FC > 2 oder < 0,5, FDR < 0,05) wurden durch RNA-Sequenzierung von MCF7-Zellen identifiziert, die 24 Stunden lang mit DMSO oder 10 μmol/L ENZ behandelt wurden.Die Upstream-Analyse wurde in der Ingenuity Pathway Analysis-Software durchgeführt.F, Überlappung von ER-Cistrom unter Behandlung mit DMSO und 10 μmol/L ENZ in MCF7-Zellen.G, Histogramm der durchschnittlichen Lesedichte um verlorene (dunkelblau), gewonnene (gelb) und konservierte (hellblau) ER-Bindungsstellen (ERBS) in MCF7-Zellen mit DMSO- oder ENZ-Behandlung.H, Western-Blot, der AR- und ER-Expression in MCF7- und T47D-Zellen zeigt, stabil exprimierte shRNA-Kontrolle, shESR1#1 und shESR1#2.I, Koloniebildungsassays mit DMSO- oder ENZ-Behandlung in Kontroll- und ER-stabilen Knockdown-Zellen.DMSO oder 10 μmol/L ENZ wurden 3 Wochen lang zu Zellkulturmedien gegeben.J, Sättigungsbindungskurve von [3H]-ENZ an ER.TB, Gesamtbindung;NSB, unspezifische Bindung;SB, spezifische Bindung;Kd, Gleichgewichtsdissoziationskonstante.SB wurde durch Subtrahieren von NSB von TB berechnet.K, [3H]-Estradiol-Konkurrenzbindungskurven.Die Daten werden als Prozentsätze der spezifischen Bindung von [3H]-Östradiol gegenüber dem log der Konkurrenzkonzentration ausgedrückt (kalte E2-Konzentrationen reichten von 1 nmol/l bis 100 μmol/l; Konzentrationen von ENZ reichten von 0,1 bis 100 μmol/l).Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Bestimmungen.Relative Zellzahlen unter DMSO und medikamentöser Behandlung am letzten Beobachtungstag wurden in den Proliferationsassays verglichen.Alle Fehlerbalken repräsentieren SD.Zweiseitiger Student-t-Test, **, P < 0,01;***, P < 0,001.ENZ antagonisierte die ERα-Aktivität in Zellen mit geringer AR-Häufigkeit.A, Zellwachstumskurven unter Behandlung mit DMSO und 10 und 20 μmol/l ENZ von elterlichen und AR-Knockout-MCF7-Zellen.Zwei Signalkolonien von Knockout-Zellen wurden ausgewählt.B, Western Blot, der die AR-Expression in elterlichen und AR-Knockout-MCF7-Zellen zeigt.C, Zellwachstumskurven unter Behandlung mit DMSO und 10 und 20 μmol/l ENZ von parentalen und AR-Knockout-T47D-Zellen.Zwei Signalkolonien von Knockout-Zellen wurden ausgewählt.D, Western Blot, der die AR-Expression in parentalen und AR-Knockout-T47D-Zellen zeigt.E, Upstream-Regulatoren von ENZ-betroffenen Genen.Melden Sie sich an oder erstellen Sie ein Konto